蛋白质修饰研究方法

发布时间:2019-10-09 11:19:33   编辑:admin浏览人次:870

蛋白质修饰
质谱
在过去的20年中,质谱已成为确定蛋白质修饰类型和位置的重要工具。
质谱法可用于蛋白质混合物,例如纯化的蛋白质或细胞裂解物。
质谱仪从蛋白质样品中产生气相离子,根据质荷比(m / z)将它们分离,并记录它们的丰度。
质谱法可用于测定多肽和蛋白质的分子量,测定多肽的氨基酸序列,检测翻译后修饰,以及多肽和蛋白质的相对定量。
该方法不能用于绝对定量。
通过质谱法,蛋白质消化或裂解物在具有限制性内切核酸酶如胰蛋白酶的小分子多肽片段上制备样品。
蒸发并分析这些多肽片段以确定它们的m / z值。
由于切割位点是已知的,因此可以使用计算机程序通过质量确定每种肽的特定氨基酸序列。
由于分子的分子量和电荷如磷酸基团是已知的,因此也可以检测肽中特定氨基酸的磷酸化。
激光解吸/电离肽图(MALDI)或纳升质谱仪可以分析消化的蛋白质样品。
然而,这些方法的局限性在于并非所有肽片段都可以被完全检测到,一些肽是清晰可见的,并且一些肽是不可见的。
这通常是分析复杂混合物的重要问题:对于修饰肽的分析和翻译后修饰,首先通过反相色谱分离肽,然后收集级分用于质谱分析(通过LC / LC分析)。MS)。
串联质谱(MS / MS)实验通常用于更准确地确定肽修饰的性质。
在MS的第一步之后,肽离子被惰性气体攻击,这导致进一步的碎裂。
然后在MS的第二阶段分析这些多肽片段。
在此过程中,一些修饰的肽将保持不变,并且所得肽模式将与不间断肽的肽模式相似。一些肽显着片段化,并且所得肽图案可具有修饰氨基酸的性质和位置。
除了用于确定单个蛋白质的修饰状态外,质谱还用于确定具有特定修饰(如磷酸化)的所有蛋白质的广泛数据集。。
这通常涉及质谱法之前的亲和色谱法。
该技术用作癌症中整个信号传导网络的活化状态的磷酸化蛋白质组分析,以鉴定具有这种修饰的二级蛋白质组。
质谱法已用于确定上述四种修饰。
然而,由于质谱法昂贵,需要专门的设备,并且通常需要更多的定量数据,质谱法可以与其他生化方法一起用于分析翻译后蛋白质修饰。经常一起使用。